面对不断进化的肿瘤，我们该如何设计新药？

对于肿瘤治疗来说，一个关键性的难题是患者会产生耐药性。肿瘤适应药物并最终产生耐药性的过程称之为肿瘤进化。肿瘤进化的能力源自于肿瘤的多样性，每位患者体内的不同肿瘤，甚至同一肿瘤中的癌细胞都可能带有不同的基因或表观遗传学改变。在抗肿瘤药物的压力下，带有特定突变的癌细胞会具有生存上的优势，这些细胞便能以牺牲其它细胞为代价继续扩张，这就是肿瘤进化的过程。

最近，来自意大利和英国的三位科学家在《Cancer Discovery》杂志上刊登了对于肿瘤进化的长篇综述。文章的作者之一是伦敦大学学院（University College London）的Charles Swanton教授，他曾发表了140多篇有关癌症进化与遗传学的论文。Swanton教授负责英国癌症研究（Cancer Research UK ）资助的一项名为TRACERx（TRAcking Cancer Evolution through therapy Rx）的大型研究，通过治疗追踪癌症进化。项目最近的研究成果发表于《自然》和《NEJM》杂志上，药明康德也曾做过特别报道。

近来肿瘤基因组检测的进步，尤其是液体活检技术，也就是从患者的血液中检测癌细胞的基因的方法的出现，使得监控肿瘤进化成为可能。到目前为止，针对癌症的靶向治疗方案还是一种“二维”的方法，也就是说通过在一个特定时间对一个特定肿瘤的检测来决定疗法。随着监控肿瘤进化的技术发展，为针对肿瘤进化的药物研发带来了前所未有的机会。在《Cancer Discovery》的综述中，详尽总结了监测肿瘤进化的技术发展，对于肿瘤进化和耐药性之间联系的研究，并提出了一些针对肿瘤进化的可能治疗策略。让我们通过本文看一下肿瘤进化的最新前沿进展。

这项研究发表在了最新一期的《Cancer Discovery》上（图片来源：《Cancer Discovery》）

监控肿瘤进化的方法

1. 多区域测序（Multiregion Sequencing）

肿瘤多样性最初被发现，即是来自于在同一时间对一位患者身上的不同肿瘤或一个肿瘤内的不同部位获取的样本进行测序。多项研究均已证实，多样性存在于各种不同类型的肿瘤中。

如果将达尔文的进化论应用到肿瘤上来，那么肿瘤多样性是由肿瘤本身基因和表观遗传学的不稳定性及其导致的多样性，加上肿瘤细胞的位置及其面对的微环境和环境压力共同造成的结果。同样的，依据不同区域的肿瘤测序结果，可以倒推出肿瘤的进化过程和进化树。不过能够取得的活检样本数是有限的，它不足以完全描述肿瘤的多样性，也无法完全描绘肿瘤进化的过程。

2. 液体活检（Liquid Biopsies）

肿瘤进化可以被认为是肿瘤多样性在空间和时间上的增长。多区域测序技术已经证明了仅通过一次活检无法完全了解肿瘤的多样性。更重要的是，活检提取肿瘤样本的过程会造成其它问题，使得反复活检的次数也受到了很大的限制。

DNA测序技术的灵敏度在最近一段时间以来获得了很大的提高，这使得从血液中分离出循环肿瘤DNA（ctDNA）成为可能。从血液中通过肿瘤特有的突变来分析ctDNA已经有了相当高的特异性和灵敏度，达到了与肿瘤组织活检差不多的程度。此外，离开了肿瘤细胞的DNA在血液循环中的半衰期仅有约2小时，这意味着可以时间上分析肿瘤中DNA突变的出现。已经有多项在非小细胞肺癌（NSCLC）患者中的研究，先通过组织活检找到一系列特定的突变，并以此为基础通过液体活检在时间上监控肿瘤多样性变化，并绘制出了肿瘤的进化树。

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液体活检能够追踪多个不同的细胞亚克隆的进化，这在已经出现肿瘤转移的患者接受靶向药物治疗时尤为有用。在这些患者中，那些对靶向药物有耐药性的基因突变出现的相对频率可以被用来评估治疗的效果以及肿瘤复发的程度。比如说，在接受cetuximab或panitumumab（这两种均为EGFR单抗药物）治疗的结直肠癌患者中，通过分析血液中KRAS突变出现的频率可以比成像诊断技术更早发现肿瘤复发。在乳腺癌和肺癌患者中也有类似的研究报道。此外，对于肿瘤ctDNA的全基因组测序还能发现染色体拷贝数和结构的变化。比如说，日本京都府立医科大学（Kyoto Prefectural University of Medicine）的庄田勝俊研究院及其同事就报道了一例胃癌患者在接受了trastuzumab（HER2单抗药物）治疗后通过液体活检发现HER2基因出现扩增的例子。广州医科大学何建行教授团队报道了一例带EGFR突变的肺癌患者在接受了2种不同的EGFR靶向药物治疗后，出现了EML4-ALK基因易位的病例，通过液体活检技术成功发现了这一基因易位后，通过ALK抑制剂治疗患者，带来不错的效果。

跟踪癌症在空间和时间的进化。1、不同肿瘤组织的平行测序；2、建立进化树。蓝色克隆代表肿瘤早期的主干突变，棕色等亚克隆代表肿瘤后期的异质性；3、液体活检可以评估不同亚克隆的生长动力学（图片来源：参考资料[1]）

肿瘤ctDNA的数量与肿瘤的类型、位置和发展程度有关。晚期的卵巢癌和肝癌、以及出现转移的胰腺癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、胃癌和乳腺癌患者中均较容易检测ctDNA，而成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、以及转移的肾癌、前列腺癌和甲状腺癌中ctDNA数量较少。一般来说，肿瘤越晚期，ctDNA的数量就越多，早期患者中不易检测。由于DNA不易穿过血脑屏障，对于脑癌或转移脑癌的患者来说，从脑脊液中分析ctDNA比从血液中分析更为有用。同样地，在胸腔积液或恶性腹水中也能够提取并分析如卵巢癌和肺癌的ctDNA，从唾液和尿液分析亦有报道。所以，从多种体液中分析ctDNA能够更好的追踪肿瘤发展的过程。不过，与多区域活检相比，液体活检能够提供的空间信息不足。比如说，无法从液体活检中判断特定的突变是来自于某一个肿瘤，还是来自于一个大肿瘤中的一部分。此外肿瘤的大小，肿瘤组织中细胞死亡的程度，以及肿瘤中血管的分布均对ctDNA有影响。

因此，有效的监控肿瘤进化需要医生仔细地选择组织活检的部位、液体活检的时间点、再加上传统技术如医学成像和分子标记物的帮助，才能够全面的了解肿瘤进化的过程。最近由英国癌症研究院发起的TRACERx研究，即是一项在非小细胞肺癌患者中进行的全面、长期研究，希望能够发现肿瘤进化的机制，并寻找其中进行治疗的策略。

治疗后出现的肿瘤进化

对患者去世后捐献的组织进行分析发现，尽管靶向药物有着明显的疗效，但是后天获得的耐药性突变不可避免地限制了患者的总体存活时间。同样地，在许多癌症中，高度的多样性往往意味着预后不佳。有证据表明，对于免疫疗法，肿瘤也可以通过多种原发和后天获得的突变来再次逃避免疫系统。因此，对于治疗的进化适应可以说是肿瘤的特征之一，如何理解和分析这一特征产生的机制，对于解决肿瘤复发至关重要。

1.原发性耐药：以激酶抑制剂为例

系统性的、高精度的肿瘤测序发现，能够产生耐药性的基因突变常常在治疗前就存在于一小部分肿瘤细胞中了，这支持了已有肿瘤细胞的进化选择是对靶向药物产生耐药性的主要机制这一理论。

比如说，对于EGFR外显子19缺失或带有L858R突变的肺癌患者来说，接受EGFR靶向药物erlotinib或gefitinib治疗后最常出现的抗药突变是T790M。在治疗前就存在T790M突变的患者其无进展生存期明显要短。另外有大约22%的患者对EGFR靶向药物的耐药性来自于MET致癌基因的扩增，而这一现象在治疗前的患者中也有发现。这些在肿瘤进化树上位于不同分支的突变在患者体内的共存解释了为什么肿瘤能过逃过针对耐药性的下一代靶向药物。比如说，在针对T790M突变的第三代EGFR靶向药物osimertinib治疗后，患者不仅会出现新的C797S突变，还有的患者体内的肿瘤带有EGFR新突变却没有T790M突变。此外对于第三代药物的突变还可能来自诸如MET、PIK3CA、ERRB2和KRAS等其它致癌基因上的突变。

同样的现象在接受了靶向EGFR的单抗药物治疗的结直肠癌患者中也被发现。在这些患者中，RAS信号通路上的突变以及EGFR受体的细胞外区域的突变是主要耐药机制。KRAS、NRAS和BRAF基因上的突变常常在肿瘤中早已存在。来自意大利都灵大学（Università degli Studi diTorino，UNITO）的一个团队曾报道过，在停用了EGFR药物后，通过液体活检发现KRAS突变的出现频率反而减少了。

2.获得性耐药(acquired resistance)

通过数学模型对于结直肠癌的肿瘤生长分析发现，多克隆耐药性很有可能不是主要来自于新出现的耐药突变。不过，尽管KRAS突变很有可能事先就存在于一小部分肿瘤细胞中，但是EGFR受体细胞外区域的突变在治疗前却很少出现，这些突变很有可能是治疗后出现的。美国麻省总医院（Massachusetts General Hospital）的Jeffrey Engelman教授的研究显示，接受gefitinib治疗后的T790M抗药突变可能同时来自于原发性突变和治疗后新出现的突变。前文中提到的意大利都灵大学团队还观察到，接受EGFR单抗药物治疗后，EGFR细胞外区域的突变出现得会比KRAS突变晚一些，这些患者的无进展生存期会长一些。这些都说明了抗药突变出现很有可能是一个两步的过程，而通过液体活检检测这一过程能够更好地指导靶向药物的使用，消灭那些带有抗药突变的肿瘤细胞库存。

多项研究还发现，耐药性的出现中还存在非遗传因素，这在肿瘤进化中也起了重要的作用。比如说，对于cetuximab有耐药性的结直肠癌细胞会分泌TGFβ以帮助附近对药敏感的癌细胞存活。在急性淋巴细胞白血病中，对γ内切酶抑制剂的耐药性通常依赖于BRD4蛋白的过表达，如果抑制BRD4蛋白，癌细胞会重新对药物敏感。而非小细胞肺癌患者在接受PD-1免疫检查点抑制剂治疗后，会通过增加其它免疫检查点蛋白的表达来产生耐药性。这些例子说明了表观遗传学的改变也是产生耐药性的重要途径。通过对于肿瘤ctDNA的甲基化程度进行分析，或者分离血液中的肿瘤细胞进行转录组分析，都能帮助了解肿瘤产生耐药性的机制。

靶向癌症进化

如果肿瘤细胞的克隆进化是最终导致对疗法产生耐药性的原因，那么通过组织和液体活检来检测克隆进化将是发现最有效的下一步疗法的关键。下面，我们来讨论一下以调节肿瘤进化为目标的不同治疗策略的理论基础、实用性以及它们的局限性。

诊断衡量癌症治疗对克隆进化的影响。通过多区域活检分析肿瘤异质性，构建肿瘤进化树并确定普遍的、共享的或私有的基因突变。液体活检ctDNA分析可以实时监测进化选择压力下肿瘤异质性的变化。（图片来源：参考资料[1]）

1、调节基因组的不稳定性

降低基因组稳定性的基因变异和表观遗传变异是促进肿瘤进化的重要原因。这一现象在很多肿瘤中都能够看到：例如BRCA-1 和BRCA-2缺失的乳腺癌和卵巢癌的同源重组修复(homologous recombination repair) 能力下降和结直肠癌中错配修复蛋白(mismatch repair protein) 功能缺失。最近，激活APOBEC家族蛋白被认为会导致大约一半人类癌症的突变率上升，它是导致NSCLC的亚克隆多样化的一个常见原因。

科学家们仍然在摸索靶向影响基因组稳定性的分子变化。其中一个众所周知的例子是利用合成致死（synthetic lethal）策略来有选择性地杀死同源重组能力缺失的细胞。这在使用PARP抑制剂治疗BRCA缺失和类BRCA肿瘤中得到了很好的体现。有趣的是，这一策略意味着如果将基因组的不稳定性提高到超出细胞可以承受的阈值，这会导致基因组完整性的崩塌和细胞死亡。而且，免疫检查点抑制剂对携带错配修复蛋白缺失的肿瘤不但效果非常显著，而且疗效持续时间很长。这表明肿瘤的基因突变负担（mutational burden）与免疫检查点抑制剂的疗效之间有正相关的关系。从这个角度来说，有意增加基因组不稳定性可能成为一种治疗策略。

另一方面，抑制基因组不稳定性可能减缓肿瘤的进展。但是这方面的成功例子还非常少，APOBEC抑制剂的疗效还需要进一步验证。可以预见的是这一策略可能对肿瘤负担和异质性较低的患者更为适用。

2、靶向克隆基因突变

既然肿瘤亚克隆中的基因异质性促进肿瘤在抗癌药物的选择压力下进化，那么直觉上来讲选择能够靶向在所有肿瘤细胞中都存在的主干变异 (trunk alterations) 会提高控制疾病的机率。例如，最近对胃癌患者的研究发现那些对FGFR抑制剂AZD4547反应良好的患者携带的肿瘤中所有克隆都一致携带着高水平的FGFR扩增。如果肿瘤中出现亚克隆或低水平的FGFR扩增，那么AZD4547疗效将随之下降。

FGFR抑制剂AZD4547的分子结构（图片来源：Selleck Chemicals）

因此药物靶点在癌症患者不同肿瘤克隆中的表达状态将帮助设计和实现降低获得性耐药性产生机率的疗法。这一策略的局限性是很多在所有肿瘤克隆中都存在的主干变异目前还无法直接靶向。例如肿瘤抑制基因APC和p53上的基因突变在所有肿瘤中都非常常见。如果能够恢复APC和p53基因的功能将导致肿瘤消退，但是目前还没有找到药理方法能够恢复这些基因的功能。

而且靶向单一主干致癌变异可能不足以维持长期疗效。例如在转移黑色素瘤中，BRAF基因突变是非常明确的主干致癌突变，但是BRAF抑制剂vemurafenib疗法与dacarbazine相比只将总生存期提高了2个月。在对BRAF抑制剂产生获得性耐药性的患者中，在一个或多个肿瘤中通常发现在MAPK和PI3K信号通路中出现多处变异。

3、组合疗法

在化疗方面，将多种有效药物合并在一起通常在治疗血液癌症和实体肿瘤时会起到更好的效果。理论上讲，同样的组合治疗模式可以用于靶向药物，比如将不同致癌症信号通路的抑制剂组合使用。数学模型同时证明了组合疗法的必要性。例如，对胰腺癌、结直肠癌或黑色素瘤患者的研究发现，对于已经转移的癌症，即便在肿瘤负担很少的情况下，单一疗法也无法根除疾病。两种药物的组合疗法只有在肿瘤负担较小而且没有交叉耐药突变(cross-resistance mutations) 的情况下才有可能根除疾病。因此，即便是靶向主干突变，也需要3种甚至更多的疗法组合才能够达到根除癌症的效果。同时，构成组合疗法的各个部分需要抑制不同的信号通路来防止交叉耐药性的产生。这种组合策略可能会受到可选择的疗法数目和对健康组织的毒副作用的限制。

4、运用免疫疗法来靶向主干基因突变

如上所述，用靶向药物影响多种主干变异可能会受到靶点成药性(druggability)和毒副作用的限制。一种克服这些限制的策略是用个体化的疫苗或过继细胞疗法(adoptive cell therapy)来靶向在所有肿瘤克隆或主要克隆中出现的新抗原(neoantigen)。运用这种方法来靶向多种新抗原能够显著降低耐药性产生的可能性。但是，肿瘤还可以通过多种手段对免疫疗法产生抗性，它们包括通过基因或表观遗传变异导致新抗原的丢失，通过选择性剪接改变免疫原性表位(immunogenic epitopes)，HLA变异或缺失，IFNg信号通路效应蛋白变异导致T细胞介导的免疫反应失常。这意味着单纯使用免疫疗法也不见得能够消灭肿瘤。它可能需要与其它形式的疗法相结合并且通过液体活检等诊断方法严格检测肿瘤的进化来最大化疗法的效果。

通过液体活检监控肿瘤进化有助于选择和整合适当的治疗策略，包括：靶向主干突变，预防性联合治疗，适应性疗法略，免疫治疗。（图片来源：参考资料[1]）

5、预防性组合疗法

虽然无法检测出来，但是很多时候对疗法存在耐药性的肿瘤细胞克隆在治疗初始时就存在。这意味着在治疗早期就使用组合疗法更可能在这些克隆细胞数目很低的时候将它们清除，而不是等到获得性耐药性能够被明确诊断出来的时候才使用组合疗法。在治疗初始就使用组合疗法的策略在治疗传染病等其它迅速进化的病原体（例如HIV）方面表现出很好的效果。在肿瘤学方面，在治疗初始就使用靶向疗法组合可以在靶向大块肿瘤组织 (bulk tumor) 的同时靶向可能产生继发耐药性的机制，与复发时才使用组合疗法相比，这种疗法使患者存活率有显著的优势。

当肿瘤中一个致癌驱动突变(oncogenic driver) 的功能被抑制时，多种肿瘤继发变异的作用通常会汇集到重新激活被抑制的信号通路上来。从这个角度上讲，能够提供垂直抑制(vertical inhibition, 在抑制一个主干靶点的同时抑制它的下游效应子）的预防性组合疗法可以减少肿瘤复发的可能。而且，同时靶向下游抗性产生的位点不但可以起到预防的作用，还能够增加对大多数肿瘤细胞的毒性，导致更深入地降低肿瘤负担。

例如在结直肠癌中，EGFR抗体疗法能够干扰MAPK信号级联反应(signaling cascade)，对EGFR抗体疗法产生的继发耐药性通常通过RAS、MEK、和MET基因突变重新激活MAPK信号通路。根据这些观察，使用针对EGFR和MEK的垂直抑制组合疗法在对EGFR敏感的结直肠癌模型中能够防止耐药性的产生。对EGFR/MEK的组合抑制疗法在EGFR基因出现变异的肺癌模型中也有类似的预防耐药性产生的效果。

限制这一策略疗效的一个因素是肿瘤耐药性产生机制的多变性。例如，BRAF和MEK抑制剂的组合能够增加黑色素瘤患者的生存期，但是肿瘤复发仍然会出现。在这些对MAPK抑制剂不再敏感的黑色素瘤中，不但BRAF、NRAS、MEK1、MAP2K1基因中富含突变，而且多条散发性的逃逸信号通路(escape pathways) 会被激活。例如在PIK3CA、AKT1、CDKN2A、PTEN基因上出现的功能获得突变和在PIK3R2、DUSP4、CDKN2A、和PTEN基因上的功能丧失突变。

需要注意的是，因为临床前肿瘤模型中的细胞数量有限，肿瘤异质性的程度可能在临床前模型中被系统性地低估了。因此，在实践中整合从大量患者中获得的组织活检和液体活检信息可能会帮助找到疗效更好的预防性组合疗法，并且抓住更好的临床时机来实施这种疗法(例如在手术切除大块肿瘤之后）。

6、自适应疗法(Adaptive Therapy)

不同肿瘤克隆之间的生存竞争也可以被用来设计创新疗法。对于肿瘤细胞来说，产生对特定药物的耐药性可能要付出细胞健康方面的代价。这些有耐药性的克隆在特定药物存在的环境下有生存竞争优势，但是如果药物不存在，它们会丧失生存竞争优势。例如在结直肠癌患者中，接受EGFR抑制剂cetuximab或panitumumab治疗的患者中会出现携带KRAS基因突变的细胞群。但是中断治疗或使用另外一种类型的药物治疗反而会导致携带KRAS基因突变的细胞比例下降。这时候重新引入EGFR抑制剂可以达到控制肿瘤生长的效果。

液体活检可作为指导适应治疗方法的工具。在对EGFR抗体敏感的CRC患者中，KRAS是常见的获得性耐药突变。当EGFR阻断被暂停时，KRAS突变在ctDNA中也会下降。（图片来源：参考资料[1]）

在实施自适应疗法的过程中，通过液体活检来测量肿瘤克隆的进化可以帮助决定暂停治疗和重新开始治疗的精确时机。一种自适应疗法的模式是通过交替使用高剂量的两种或两种以上靶向肿瘤中不同分支克隆和耐药性机制的药物来控制肿瘤生长。另一种方法是持续使用降低剂量的药物来达到控制肿瘤生长而不是消灭肿瘤的目的，这种方法称为节律疗法(metronomic therapy)。在乳腺癌异种移植模型中，节律化疗反而比完整剂量的化疗更为有效地控制肿瘤生长。

利用生物标记物和对肿瘤进化的实时测量来指导治疗

目前癌症精准医学通过有预测能力的生物标记物信息来帮助确定最有效的治疗方案。将详尽的后续研究与多区域组织活检以及对肿瘤异质性的分析相结合，可能帮助提高预测肿瘤进化的精确程度。通过这些研究，我们希望能够获得对肿瘤进化规律的全面了解。比如发现哪些癌症驱动基因的变异总是发生在所有克隆中，而哪些变异很少会在所有克隆中发生。又如确定在某种抗癌疗法的选择压力下与癌症进化相关联的分子特征。

另一方面，对同时靶向大块肿瘤和耐药性机制的药物组合疗法，在临床前和临床研究中将为发现有效的预防性组合疗法提供非常宝贵的信息。已有研究表明，对患者组织样本的测序本身不足以预测组合疗法的效果。这意味着从患者身上获取的肿瘤细胞可以作为补充，来检测哪种组合更为有效。

未来，对特定肿瘤进化模式的了解可能帮助靶向用药。例如在肺癌中的T790M突变会让耐药性克隆对第三代抑制剂敏感。而结直肠癌中的EGFR细胞外域发生的突变能够有效地被MM-151抗体靶向。

液体活检在临床上的应用将可以提供对肿瘤进化的实时检测。这能够让医生们布置相应措施来选择能够约束肿瘤进化的最好治疗方案。标志着对特定靶向疗法的耐药性／敏感性的生物标记物和预测对免疫疗法反应的替代指标可能会成为衡量疗法是否成功的终点。

未来的研究方向

通过多区域测序和液体活检对肿瘤进化的研究增进了我们对癌变过程和肿瘤逃脱治疗机制的理解。技术的进步和测序成本的降低将进一步促进这方面的研究进展。单细胞分析技术可以在样本数量有限的情况下仍然能够高分辨率解读肿瘤的异质性。而测序成本的进一步下降和标准化平台的应用范围的增加将导致液体活检在临床上更为广泛的应用。

由于表观遗传变异也可以成为耐药性性产生的机制，而且肿瘤微环境的变化对免疫疗法的反应也有重要影响，因此我们需要分析循环肿瘤DNA的新模式来探索这些方面的信息。对从外泌体或循环肿瘤细胞中获得的肿瘤RNA进行转录分析可能让我们获得促进肿瘤进化的非遗传驱动子方面的信息。对T细胞受体的遗传分析可能帮助我们跟踪T细胞根据肿瘤进化而产生的相应“进化”。

总体来说，通过多区域组织活检和液体活检发现肿瘤进化特征，可以提供针对患者肿瘤进化和肿瘤微环境特征的创新治疗策略。

参考资料

[1] Tumor Evolution as a Therapeutic Target

来源：药明康德（微信号 WuXiAppTecChina）