肝脏细胞的获取及其在3D生物打印中的应用

在第一届Regenovo生物3D打印学术论坛上，来自中科院上海生命科学研究院的惠利健教授分享了一些在3D生物打印中肝脏细胞获取方面的研究工作成果。

三维打印不可或缺的三样东西，一个材料，一个生物细胞，还有一个是打印的设备。我的研究方向是功能肝细胞的获得，今天我想给大家讲讲过去怎么获得细胞和细胞在3D打印上的一些可能的应用，以及如何从基础走到一些应用方面的。

原代肝细胞间互相会形成非常紧密的连接，这是上皮细胞的一种特点。肝细胞有很多用途，比如说药物筛选、人的疾病模型，还有20年前大家开始用肝细胞移植来治疗代谢性肝病等等一些中末期疾病。

肝脏细胞的来源与获得

细胞来源的获得是一个大问题，这个问题的存在也由来已久。从干细胞生物学的角度来看，存在以下几种可能性。

其中一种就是ES细胞（Embryonic stem cell）即胚胎干细胞分化，ES细胞它具有全能性，可以分化成身体的所有功能组织细胞。另一种是可诱导多能干细胞（iPS，Inducedpluripotent stem cell）分化。这两种细胞在功能上以及很多方面都非常类似，可以在体外进一步定向分化成肝脏细胞。但是这两种方法都很困难，费时费力，成本也很高。

我们使用的是一种可以成纤维细胞直接变成肝细胞（hiHep）的转分化方法。有了这个hiHep细胞之后，可以对它的功能进行一系列的分析比如肝脏分泌的白蛋白、AAT等，还可以分析其脂代谢、糖原代谢以及一些解毒功能。此外，实验证明了这些hiHep细胞移植到体内之后能够部分地治疗患有肝脏代谢性疾病的小鼠。

形态对比

既然现在可以有转分化hiHep，它和由ES和iPS在定向分化成的肝细胞来比有什么不同？为此我们做了一系列的比较，发现它们在形态上其实非常接近，从白蛋白和AAT这两个肝脏特定的分泌蛋白的染色来看，百分之八九十的细胞都是双阳性的，证明这些最后重编程获得的肝细胞纯度非常高。从一些功能相关的基因表达上面来看，也和原代肝细胞也非常接近。

功能检测

肝脏最重要的功能就是代谢，肝脏代谢主要就是胆汁排泄功能和CYP酶的氧化功能。从三种不同的与胆汁排泄相关的药物进行的实验来看，在hiHep、iPS分化获得的肝细胞和原代肝细胞这三种细胞中呈现的结果整体上是非常接近的。

从另外一个CYP3A功能的项目中，可以看到iPS分化得到的肝细胞和hiHep都有很好的代谢功能，当然，原代肝细胞代谢功能更好。

AFP是胚胎肝里面表达的甲胎蛋白，只有在胚胎时期的肝脏才分泌。iPS来源的肝细胞甲胎蛋白表达特别高，就证明这个细胞其实成熟度不是特别高。用AFP染色去分析，可以看到iPS来源的肝细胞这些标志物表达量都很高，而hiHep细胞的表达量很低，原代肝细胞也不表达。相比之下，说明hiHep细胞相对于iPS来源的肝细胞更成熟一点，在体内的效果可能更好。这些工作证明，看起来都非常接近的两个细胞，实际上还有很多不一样的。

临床再生医学的应用和体外的三维培养

这些细胞要应用在临床的移植，就会面临很多技术挑战。幸运的是，早前就已经有设计好的体外人工肝支撑系统，可以在体外帮助肝衰竭的病人获得一些功能性的支撑。血浆经过生物人工肝中的肝细胞解毒代谢或者获得营养成分以后再流回体内。这样的技术支持，可以让我们培养的肝细胞避免进入体内，从而解决了排斥或者致瘤性这样的问题。

小鼠实验：

小鼠实验用到了刀豆蛋白诱导的急性肝衰竭模型。实验结果显示成纤维细胞和HepG2细胞都没有治疗效果，而用hiHep细胞和原代肝细胞的组，小鼠有30%~40%的成活率。

大动物实验：

大动物实验我们选择了肝衰竭的猪模型。肝衰竭猪的在体外流经生物人工肝装置的反应器，最后又回到猪的体内。急性肝衰竭的猪如果不接受治疗的话会快就会死亡，而经过生物人工肝的装置治疗后，有接近80%的动物都活了下来。

对此我们也做了一系列详细的分析，包括血氨等一些血生化指标检测。更重要的是治疗后的肝脏里面有很多平时看不见的增殖细胞，证明了在生物人工肝治疗之后，诱导了肝脏再生。

现在我们也开始在患者中开展安全性临床研究。

体外实验：

在体外用肝细胞能够构建微器官，这要考虑到功能和结构形态。结构形态是保证功能非常重要的一点。器官中最核心的一点是血管。血管的供血和养分供应一旦出问题，器官或者微器官就会出问题。

为了构建微器官，我们首先把hiHep细胞形成一个单细胞的组织。我们将hiHep细胞放在一个特殊的培养皿中，细胞会自己聚团并在上面形成一个微球，这些细胞可以增长，大概长到差不多维持在200到300微米这个大小的时候就会停止。其次，我们需要先把血管内皮细胞和hiHep肝细胞进行共培养。我们发现HUVEC和hiHep细胞可以很好地在一起。

下一步可能会开始考虑形成胆管这样的结构。从长远角度来说，如果形成这么一种有胆管和血管的一个肝脏微器官，我们可以用它们来研究再生、纤维化等等。如果这些肝脏微器官最后证明是安全的话，那么可以用这些微器官在肝脏患者中进行移植。

来源：火石创造（微信号 firestone-link）   作者：惠利健 整理：叶文婷 赵成龙