刷屏的张锋团队CRISPR重磅新应用缘何如此厉害？背后竟有诺奖级技术的支持！

华人科学家张锋大神又刷屏了。他和James Collins教授团队，联合将CRISPR-Cas13a改造成了灵敏度达到了阿摩尔级（aM，10的负18次方摩尔每升），可以检测单分子的SHERLOCK技术。这一重要成果刊登在今天的《科学》杂志上[1]。

就在大家在为张锋大神欢呼雀跃，在为CRISPR-Cas13a叫好的时候。我们发现，让SHERLOCK技术达到阿摩尔级灵敏度的不是CRISPR-Cas13a，是它的搭档，另一个颠覆性的发明重组聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）。很少有报道提起她，她就那样默默站在CRISPR-Cas13a背后。

RPA有多厉害？据说可以媲美PCR技术。什么是PCR？着名发明家Kary Mullis因为发明这个技术于1993年获得诺贝尔奖……据了解RPA技术是由英国科技公司TwistDx发明的，发明人是Niall A. Armes和Derek L. Stemple。如果张锋和Collins教授的这项发明最终能造福人类，我们也应该记住RPA的发明人。

接下来我们就看看RPA和CRISPR-Cas13a联手，如何铸就SHERLOCK技术的。

SHERLOCK与我们特别熟悉的CRISPR-Cas9有本质上的区别，它使用的酶是Cas13a。Cas9靶向切割的是DNA，而Cas13a靶向的则是RNA；而且Cas13a是一个“奇怪而又疯狂”的酶，像Cas9在切割完特定片段后就会失活，但Cas13a则会像“吃了炫迈一样停不下来”，在切割了自己应该切割的RNA后，它还会继续去切割其他遇到的RNA。

其实在去年的6月份，张锋教授就在《科学》杂志上介绍过这个可以在细菌细胞中切割特定RNA序列的“奇怪而又疯狂”的酶了[2]。然而在面世仅仅三个月后，另一位在CRISPR基因编辑系统领域做出卓越贡献的“大神”就“找了个茬”，我想，大家应该已经猜到了，这位大神就是与张锋教授有着专利之争的，加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna教授。

Doudna教授和她的同事在《自然》杂志上发表研究，他们对Cas13a的潜力进行了验证。结果显示，如果想要让Cas13a顺利地与特定RNA结合，样本中至少需要数百万RNA分子，因此，使用Cas13a其实是达不到许多基础研究和临床应用所需要的灵敏度的[3]。

初始的Cas13a和“进化”后的SHERLOCK灵敏度的对比初始的Cas13a和“进化”后的SHERLOCK灵敏度的对比

这样的CRISPR-Cas13a是不能被称为“SHERLOCK”的，那么张锋教授是如何让它“开挂般”提高灵敏度的呢？这还要感谢和张峰教授同在Broad研究所工作的，合成生物学领域的“大牛”——James Collins教授，他同时也是这次报告的联合通讯作者。两位“大牛”携手，他们想到了一个“外援”—— RPA。

常规的PCR也可以扩增特定DNA片段，提高灵敏度，但是PCR对温度的控制有很复杂的要求，要经历高温变性、低温复性还有中温延伸三个步骤。RPA就不需要这么麻烦，它的反应需要三种在常温下有活性的酶，最适温度在37-42℃之间，不需要变性过程，这样就大大加快了扩增的速度。再加上不需要温控设备，两者共同打造了真正便携式的快速DNA扩增技术。

不仅方便快捷，RPA更“迷人”的地方在于扩增量十分高，能够将痕量的核酸（尤其是DNA）模板扩增到能够可以检测到的水平。痕量，顾名思义就是“该物质虽然存在，但只有‘痕迹’，无法用一般方法定量检测，通常含量＜0.1mg”，所以大家就知道RPA有多厉害了吧？利用它可以从单分子得到大约1012的扩增产物。而且RPA还不需要复杂的样品处理，及时环境限制，无法提取核酸，也难不倒它[4]。

利用RPA，在室温中，样品中DNA或RNA的含量就可以得到提升，一旦含量增加了，再将DNA转化为RNA。如此，Cas13a就有资格进化成“SHERLOCK”了！

不过SHERLOCK其实是一个“团队”，研究人员给Cas13a“配备”了两个助手：一个是引导它到达应该被切割的特异性RNA的“向导RNA”；另一个叫做“报告RNA”，因为Cas13a在切割完特定RNA后不会失活，所以在Cas13a完成任务开始“作乱”的时候，报告RNA就会被切断，发出荧光信号。研究人员们就知道，它已经找到了与其相匹配的RNA序列。

SHERLOCK的工作原理

那么SHERLOCK现在能为我们做什么呢？研究人员已经证实，它可以应用于多种疾病，例如传染病病原体的检测、癌症相关的基因突变的检测。

使用SHERLOCK可以分辨出美洲寨卡病毒和非洲寨卡病毒，两种病毒株差异显著

在研究中，他们用含有寨卡病毒和登革热病毒的血样进行了测试，结果显示，即使病毒的滴度（即病毒的毒力）很低，SHERLOCK还是能捕捉到，而且对于类型很是相似的非洲寨卡病毒和美洲寨卡病毒，SHERLOCK也能准确的分辨出它们的“身份”。除了血液之外，唾液和尿液也都可以“为SHERLOCK所用”。

除了病毒的检测外，在大热的癌症液体活检方面，SHERLOCK也显示了一把它的身手。在人体内，每时每刻都有DNA片段进入血液循环中，对于肿瘤患者来说也不例外，所以血液中也能检测到与肿瘤有关的DNA片段。但是肿瘤相关DNA的比例极低，因而检测的难度也是很大的。在研究人员的设计下，他们用酶将DNA转化为RNA，这样SHERLOCK就可以靶定血液中的与肿瘤有关的突变了！

研究人员以两个基因突变为例，进行了验证，他们发现，即使突变的基因只占到基因组DNA的0.1%，SHERLOCK还是能够将它们检测出来！这无疑会为液体活检领域带来不小的进步。研究的第一作者Jonathan Gootenberg说：“SHERLOCK对两种类型的核酸（DNA和RNA）都很有用，它真正的优势在于切割完特定片段之后还具有活性，能够触发‘荧光报告’，让我们知道。”

在人类基因组中，SHERLOCK可以检测出不同的多个单核苷酸多态性（SNP）

除了这些之外，SHERLOCK还可以检测人类基因组中的多个单核苷酸多态性（SNP，指基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列的多态性，是人类可遗传变异中最常见的一种）、抗生素抗性基因、区别包括大肠杆菌和铜绿假单胞菌在内的5种特定类型的细菌，而且根据研究人员的介绍，SHERLOCK甚至还可以区分肺炎球菌和杆菌不同的耐药突变类型！这些对于细菌感染患者的诊断、治疗都有非常重大的意义。

对于如此强大的SHERLOCK，曾经“挑过刺儿”的Doudna教授表示，“未来有很多疾病的检测会应用到SHERLOCK，我们很高兴看到他们的新成果建立在我们曾经提出的‘疾病检测’的主意上，而且我们曾经的‘检验工作’看起来对他们也非常有帮助。”[5]

目前，SHERLOCK在使用的时候可以将所需要的化学物质放在一张玻璃纤维纸上，在各种场景中使用，而且每次的成本只需要61美分。研究人员认为，如此方便、快捷的测试对于新传染病爆发时的准确检测有着十分重大的意义，因为传染病最开始出现的地方往往是一些环境较差的不发达国家。

由于SHERLOCK广泛的应用范围，所以如何“商业化”也是研究人员很关心的一个问题，Collins教授说，他们目前正在积极的探索中，很可能会成立一家公司来实现这个目标。当然了，商业化的SHERLOCK什么时候能够正式进入市场，这一切都还需要技术的继续完善和FDA等机构的监督和认可。

参考文献：

[1]Jonathan S. Gootenberg et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 2017 DOI:10.1126/science.aam9321

[2] Abudayyeh O O, Gootenberg J S, Konermann S, et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector[J]. Science, 2016, 353（6299）： aaf5573.

[3] East-Seletsky A, O'Connell M R, Knight S C, et al. Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection[J]. Nature, 2016, 538（7624）： 270-273.

[4] Piepenburg O, Williams C H, Armes N A, et al. Recombinase polymerase amplification: U.S. Patent 7,399,590[P]. 2008-7-15.

[5] http://www.sciencemag.org/news/2017/04/new-crispr-tool-can-detect-tiny-amounts-viruses

来源：奇点网   作者：应雨妍