CRISPR/cas9基因组编辑技术因其设计简单以及操作容易,使其在基因编辑的研究中越来越受到欢迎。利用该技术,科研人员可以实现在碱基的水平对基因组进行定点修饰。CRISPR系统现已经被广泛地应用到多个物种的基因组编辑以及癌症的相关研究中。近期来自哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学教研室在最新研究进展的基础上,结合对癌症研究及基因组编辑技术的理解,对CRISPR/Cas9技术在癌症研究中的应用进行了综述。
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是在细菌中发现的适应性免疫反应系统(Adaptive immune system),能有效抵抗噬菌体(Bacteriophage)等对细菌造成的损伤。在这套系统的基础上,科学家发展出一种新的基因组编辑技术—CRISPR/Cas技术。现在所广泛使用的CRISPR/cas 9系统是由II型CRISPR改造而来,并应用到分子生物学的相关研究中,成为一种可用于基因组编辑的分子生物学利器。
CRISPR/Cas9系统由于没有物种的限制,已经成功在小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、水稻(Oryza sativa)等多种动物和植物中实现了基因的精确编辑。近年来CRISPR/Cas9的应用得到更进一步的发展,如调控基因的转录激活和抑制等,丰富了分子生物学研究的方法并被应用到各种研究中。
CRISPR/Cas9系统由单链的sgRNA和有核酸内切酶活性的Cas9蛋白构成。当Cas9酶剪切基因组时可以在PAM(Protospacer-adjacent motif)序列前产生一个双链的切口(Double-strand breaks ,DSBs),由于细胞基因组具有自我修复的功能, 通过非同源末端连接(Nonhomologous end-joining,NHEJ)的方式可以使基因组发生随机的INDEL效应(Insertion and deletion)。当细胞内具有基因组同源臂的序列存在时,基因组会进行同源修复(Homology-directed repair,HDR),从而实现基因组任意位点的序列编辑。
基于此,科学家实现了对基因组的精确编辑并且将其应用于遗传病的治疗。对动物受精卵或者体细胞导入Cas9蛋白的mRNA,以及包含特定靶点序列的sgRNA(如果是基因组突变则需包含同源序列的模板),即可实现动物体内基因的失活或缺陷基因的修复。癌症一直是人类所面对的最主要的疾病之一,也是当前主要的研究领域之一。由于CRISPR/Cas9系统具有设计简单和易于操作的优点,研究者们将CRISPR系统创造性地应用于癌症的研究中。CRISPR系统的应用不仅丰富了癌症研究的技术手段,更提供了癌症研究的新视角和新思路。
在这篇文章总,作者对近期CRISPR/Cas9技术在癌症研究中的应用进行综述。并指出,CRISPR系统使研究者可以快速简单地对基因组进行精确的编辑,自该方法建立以来被广泛应用于分子生物学研究中。这一技术可以实现DNA的定点突变、基因敲入、Mb级别的片段删除、miRNA及长链非编码RNA的敲除、激活或抑制内源性的基因表达、分子的标记示踪等。由此发展出几种组织特异性编辑的方案,如应用病毒将CRISPR系统导入特定的组织或细胞,或使用特殊的组织特异性启动子等方法,更加适用于疾病机制及治疗的研究。而这些方法可有效应用于癌症相关的分子机制的研究,可以使机制更加的丰满及可信。
CRISPR系统方便快捷,近年来发展迅速。但是由于CRISPR系统的特异性是由碱基配对所决定的,由此带来的脱靶问题依然是这个系统面临的最主要问题。已有研究将Cas9蛋白的结构域(D10A)进行突变建立了CRISPR配对切口酶系统,从而大大提高了CRISPR系统的特异性减少了脱靶的发生,同时也更有利于基因编辑的准确性。最近研究表明改变miRNA的表达可使肿瘤细胞恶性程度降低。因此对重要的基因或者miRNA进行编辑或者突变具有潜在的治疗癌症的作用。
CRISPR系统不但可以对基因组进行编辑,而且还可以实现内源性调控基因的表达,如使用突变的dCAS9 蛋白并且融合了转录激活结构域,可以在sgRNA的引导下结合到特定基因的启动子区域实现基因的内源性调控。 因此随着CRISPR在临床上的逐步应用,未来很有可能针对癌症实现基因治疗,对癌症细胞的基因组进行修复,如突变、染色体变异、拷贝数变异、调控肿瘤细胞基因的表达等,从而最终实现癌症的基因治疗。
这篇文章综述了目前CRISPR/Cas9技术在癌症方面的研究进展。相信在不久的将来CRISPR技术将像PCR技术一样很快融入到分子生物学的各项研究中,可以帮助研究者快速地进行动物体基因组的编辑,构建基因敲除以及精确的基因突变的小鼠,进行全面的基因功能研究以及遗传性疾病的基因治疗。
来源:生物通
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