韩春雨NgAgo-gDNA基因编辑技术再遭质疑,多国科学家称无法重复其实验

韩春雨河北科技大学副教授韩春雨震惊全球学术界的新基因编辑技术NgAgo-gDNA,正遭遇越来越多的质疑。从5月2日他的论文发布在《自然-生物技术》网络版之后,到现在为止,全球仍没有一家实验室对外宣布,能够完全成功重复韩春雨的实验。现在已有多国科学家要求《自然-生物技术》介入调查,并公开韩春雨实验中的所有原始数据和实验条件。

北京时间7月29日,一度支持韩春雨的澳大利亚国立大学的基因学家Gaetan Burgio,反戈一击。他在Twitter上发布长文《我的NgAgo经历》,否认了自己7月15日之前部分重复实验时得出的结论,表示并无严格意义上的证据显示韩春雨的NgAgo-gDNA技术有基因编辑的迹象,并且要求韩春雨公开所有原始数据和实验条件。

韩春雨的NgAgo-gDNA技术,挑战的是最为流行的基因编辑技术CRISPR-CAS9,论文刚一发表,就引发了轰动。基因编辑技术是指能够让人类对目标基因进行“编辑”,实现对特定DNA片段的敲除、加入等。目前CRISPR-CAS9是最为普遍的基因编辑技术,被称为“基因魔剪”。 5月2日,韩春雨课题组的论文《DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute》在《Nature Biotechnology》在线发表。绕开时兴的CRISPR-CAS9技术,课题组利用格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)的Argonaute核酸内切酶,以DNA为介导进行基因组编辑,简称NgAgo-gDNA。

质疑韩春雨的Gaetan Burgio在7月29日发布的长文中介绍了重复实验的具体过程操作和结论,附带了7张实验结果图。


受精卵原核注射NgAgo之后,基于囊胚的PCR结果。


对NgAgo注射过的受精卵PCR产物的T7核酸内切酶检测。


当用高浓度5'磷酸化的ssDNA(25纳克/微升)和NgAgo原核注射小鼠受精卵之后基于囊胚的PCR和电泳凝胶。


对小鼠囊胚进行NgAgo、5’磷酸化ssDNA原核共注射之后获得囊胚,进行DNA提取、PCR扩增和测序之后的一个典型测序结果。


微注射NgAgo的小鼠受精卵凝胶电泳。


代表性的所有电泳胶的序列的Clustal比对。Ank-1作为参考序列。


一个代表性测序色谱图(使用反向引物测序)。

他表示:在多番尝试、试验3个不同的细胞后,没有发现严格意义上证明NgAgo发生基因编辑的证据;在他看来,NgAgo酶需要加热到50摄氏度才能有效,对37摄氏度下NgAgo内切酶的活性表示质疑。

在长文中,Gaetan Burgio表示,“《自然生物技术》期刊应该要求韩春雨公开所有的原始数据和实验条件”,并认为:“NgAgo的未来并不明朗。”

关于这句“NgAgo的未来并不明朗。”,方舟子在今日转发这篇文章时表示:翻译有些问题。Burgio并不是说“NgAgo的未来并不明朗”,而是说“NgAgo很显然没有前途”。


Gaetan Burgio选择了小鼠受精卵进行重复实验。因为他长期研究小鼠细胞,较为熟悉,并在两年半前,用小鼠细胞,完成了他的首次CRISPR-Cas9基因编辑。由于韩春雨的论文中使用的是人体细胞,严格意义上来说,Gaetan Burgio和韩春雨所做的不是同一个实验。但由于小鼠和人体结构相似,一般认为人体细胞能完成的实验也能在小鼠细胞上进行。

在Gaetan Burgio发文后不久,来自西班牙高等科学委员会(CSIC)下设的国立生物技术中心(Centro Nacional de Biotecnologia)的科学家Lluis Montoliu转发了该文,并在Twitter上写道:“CRISPR万岁!!!CRISPR-Cas9系统会用上数百亿万年而不衰。难以击垮。”


据公开资料显示,2015年,Lluis Montoliu从非营利组织“国际转基因技术协会”(The International Society for Transgenic Technologies)卸任主席之位。他的Twitter简介显示,Lluis Montoliu的研究方向是哺乳动物的基因组,以及基于转基因动物研究人类的罕见疾病。

Lluis Montoliu在Twitter上透露,在NgAgo之前,他们曾用大约2年时间,试图测试Ago家族中来自Thermus thermophiles嗜热栖热菌的酶TtAgo,但同样失败。

随后,7月30日,Lluis Montoliu更新博文称,他已经停止了所有关于NgAgo的项目,同时“建议所有想做这件事人不要再浪费资源”。

7月30日傍晚,方舟子在Twitter上贴出四张邮件截图,并附文称“国际转基因技术协会原主席Montoliu今天向协会会员发信,建议停止验证河北科大韩春雨实验,不要再浪费时间、金钱和人员。针对该技术调查表明,140个回复中,只有一个(中国神经所仇子龙?)回答有效,73个无效,63个在验证。”

图片显示,发件方为代表Lluis Montoliu的“国际转基因技术协会”,邮件名为“对Ago的巨大失望:CRISPR万岁!”,发送时间为当地时间7月29日上午9点49分。邮件用加粗字体写道:“(目前最重要的信息是)NgAgo在哺乳动物细胞的基因编辑中不起作用”、“我建议所有人放弃涉及NgAgo的项目”。

方舟子所贴的邮件截图

但Lluis Montoliu及其所处的“国际转基因技术协会”的言论,引发了部分国内科学家的不满,其中包括中国科学院上海神经科学研究所研究员仇子龙。7月30日晚上,他在实名认证的微博上质疑“国际转基因技术协会”和Lluis Montoliu在领域内的专业性。

仇子龙发文质疑“国际转基因技术协会”和Lluis Montoliu在领域内的专业性。此前,仇子龙被传出重复实验成功。7月20日,科学网有博文称仇子龙成功重复韩春雨的实验。但仇子龙本人在7月21日作出回应,表示实验室仍在重复,优化各种条件,目前的实验结果距离韩春雨论文中的结果“相差甚远”,并呼吁韩春雨提供“可重复NBT发表文章的NgAgo,或者优化的Ngago2.0,smart版本等等”。

对NgAgo的质疑声自6月下旬开始就陆陆续续,韩春雨本人在百度贴吧上做出过一些回应。

6月28日,他在对网友的回复中表示,新系统刚出来都会“不好使”,他也认同目前NgAgo系统不够稳定,等2.0版本出来会找专门机构免费发放。

面对质疑,他说,“我敢把质粒提交到addgen上,在协和讲座发放质粒,对自己实验的重复性还是很有胆气的。”韩春雨所说的“addgen”其实是Addgene,一家全球科学家质粒共享的非盈利组织。澎湃新闻(www.thepaper.cn)在Addgene官网上的确看到了韩春雨上传的质粒信息。这些质粒可供全球科学家直接用于重复韩春雨的实验。7月2日,在贴有方舟子质疑原文的帖子中,韩春雨进行了较为详细的回应,强调NgAgo系统对污染特别敏感,实验时不要有寄生菌和支原体的污染,并对实验环节做出技术性的建议。

但7月2日之后,韩春雨不再有新的回复。7月4日,澎湃新闻(www.thepaper.cn)联系上韩春雨,他以“学校告诉我不要做任何回应”回绝。

有基因学家对澎湃新闻(www.thepaper.cn)表示,如果最终《自然-生物技术》杂志在介入调查后也认为韩春雨的实验是无效的,那么他在5月2日发表的论文将会被《自然-生物技术》删除。

文/澎湃

医谷+

方舟子《河北科技大学韩春雨“诺贝尔奖级”实验的重复性问题》质疑全文

一个新的科学发现、技术,需要经过别人的重复才得到公认。别人重复不出来,有疑问,是很正常的。作为首创者应该做的是去消除疑问,而不是攻击、谩骂,否则那更让人怀疑。

不久前河北科技大学韩春雨在《自然·生物技术》发表论文报告了一种基因编辑新方法NgAgo,在国内轰动一时。被《知识分子》作为末流学校土博士也能做世界一流科研的典型,国内其他媒体随后跟进宣传,甚至称之为“诺贝尔奖级”的研究成果。

这几天我陆续收到几家实验室的研究人员的来信,反映重复不出韩春雨论文中最关键的图4结果(切割基因组,T7E1和测序),呼吁我关注一下这事。

图3

图4

有些人已在网上生物专业论坛公开讨论此事,报告他们没法重复该实验,询问有谁重复出来了。目前还未见有人反映重复出了图4结果。有的能够重复论文中的图3结果(FACS和Western Blot),但那有可能是假阳性。

据听报告的人说,韩春雨在北大和遗传所的报告上都强调,他目前的NgAgo是初级版、需要高超的实验技巧、等他推出2.0版和Smart版。这些说法跟他在论文里的描述是矛盾的。因为他描述的只是个并不复杂的转染实验,T7E1和测序也都是现成的技术,并不需要高超的实验技巧,按照其提供的步骤应该是不难被重复出来的。

韩春雨获悉有人重复不出其实验结果后,不是解答疑惑,而是谩骂这些人是“跳梁小丑”、是搞别的基因编辑技术(CRISPR)的人的抹黑,威胁要对他们进行人肉搜索。

我当然不怕被人肉,也不怕挨骂,所以在此问几个问题:

第一,有没有人重复出了韩春雨论文中的图4结果?有的话跟我说一下。

第二,据称韩春雨在遗传所的报告上说,重复出来和不能重复的比例是1:3,能重复出来的有20家。那么究竟有哪家实验室重复出来了?(指图4结果)这事没必要保密吧。

第三,韩春雨说做这个实验“需要高超的实验技巧”,那么究竟在哪个步骤需要什么样的高超实验技巧?

为什么一个新实验的结果别人都反映重复不出来,原因很多,比如可能是重复出来的都不吭声,重复不出来的实验技术不行,论文中隐瞒了关键的“实验技巧”(这不道德),或者论文报告的结果干脆就是编的(这更不道德)。一个新的科学发现、技术,需要经过别人的重复才得到公认。别人重复不出来,有疑问,是很正常的。作为首创者应该做的是去消除疑问,而不是攻击、谩骂,否则那更让人怀疑。

对于方舟子的质疑,7月2日,韩春雨在百度贴吧“国际米兰吧”发帖做出了回应。

一位名为“第十三米的阳光”的吧友引用方舟子质疑文章中的内容在该贴吧内发帖。

随后,韩春雨用自己的“槐北路”的账号进行了回复。

很多网友对韩春雨表示了支持。

韩春雨在回复中,对于方舟子的质疑一一详细作答。

方舟子质疑1.:图片3:有人能重复(FACS和Western Blot),但那有可能是假阳性。

韩春雨回复:高超的技巧,其实也很简单,细胞做好检测,不要有寄生菌污染,不要有支原体污染(Ago系统对污染特别敏感---特别是单转guide假阳性---我非常确定在没有污染的情况下,单转guid不会影响GFP表达,假阴性也大多因为细胞污染,假阳性和假阴性我都遇到过,国内买的细胞我就不吐槽了),转染用的质粒质量要好(可用30ngGFP转细胞,若是均一且效率高表明质量好,强弱不均一则表明质量差,越不均一表明质量越差),guide磷酸化完全(没有磷酸化不能load和切割---谢谢印证我的Fig2结果,至于怎么检测,自己跑个PAGE看看---)。

方舟子质疑2:目前还未见有人反映重复出了图4结果,据称韩春雨在遗传所的报告上说,重复出来和不能重复的比例是1:3,能重复出来的有20家。那么究竟有哪家实验室重复出来了?(指图4结果)这事没必要保密吧。

韩春雨回复:特别的,对于Fig4,也是几乎惟一算是有难度的,就是控制转染时的细胞密度和用血清控制细胞生长,时间稍长,毕竟NgAgo未经过系统的密码子优化---照着online method上protocol for genome editing and T7E1做(小经验,PCR最好不要有引物二聚体,如果引物二聚体多请重设引物;PCR产物直接回收最好不跑胶回收,可能跟ago切24bp有关,设好对照!)---银染分辨率高,可以排除T7E1假阳性,能做出预期条带后请用PCR产物去测序--------欢迎大家广泛使用此系统,并分享成功经验和失败教训。附,addgen上的质粒,可以直接用作基因组编辑。再次强调,不加NgAgo,就能抑制GFP,是假阳性,是细胞出问题了(谢天谢地不但我自己而且审稿人也有这个对照)出现假阳性的细胞切基因组就没戏了。对于Fig4,若是不习惯做银染,也可以直接做KI:doner 用GFPcoden+polyA signal,前后加几个保护性的碱基---从GFP-N1扩出来连到T-vector上,再从此doner-Tvector上扩(防止GFP-N1污染的假阳性)出来纯化,500-800ng共转(for each well of 24 well plate)。

同时,韩春雨针对知乎上的一些质疑,也做出了回复,并无奈表示“我这么苦口婆心的……”

财新网的相关报道

国际科学家质疑韩春雨“诺奖级”实验不能重复

由于实验难以被重复,韩春雨数月前发表在国际顶级期刊《自然·生物技术》的一项研究成果,正收到一些同行科学家的质疑。

2016年5月2日,河北科技大学生物科学与工程学院生命科学系副教授韩春雨课题组的论文《DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute》在《自然·生物技术》在线发表。

7月29号,一篇博客将韩春雨的“实验无法重复”的质疑声推向了高潮。澳大利亚国立大学医学、生物和环境学院教授,寄主-病原体相互作用原理和基因编辑课题组负责人盖坦·巴尔焦(Gaétan Burgio)把自己近两个月来,以小鼠为实验对象的NgAgo基因编辑实验数据和结论分析公开在博客里。

博客称,经过多次尝试后,他仍旧没有发现任何证据证明NgAgo能进行基因组编辑。并且NgAgo似乎需要在50℃以上的实验条件下才能起作用,与韩春雨文章中的37℃常温是矛盾的。

因此,巴尔焦呼吁《自然-生物技术》杂志介入,要求韩春雨公开原始数据。

与此同时,7月30日下午,国际转基因技术协会原主席路易斯·蒙特柳(Lluis Montoliu)通过邮件也告知财新记者,他曾经对NgAgo抱有极大的期望,但是韩春雨的文章发表至今,国际上他所知道的重复实验的结果无一例外都是失败的。

对此,韩春雨回应,他认为目前的质疑声音是“非科学”的,而一项研究成果是非对错,应由科学决定。

截止记者发稿前,《自然》出版集团并未有对韩春雨研究结果的进一步发布,也并未回复财新记者的问询邮件。

媒体追捧为“诺奖级”科学家

2016年5月2日,英国 《自然•生物技术》杂志(Nature Biotechnology)刊发了中国科学家团队发明的一种基因编辑技术NgAgo-gDNA。由河北科技大学韩春雨副教授和其研究团队发现的这种基因编辑技术,不同于目前大热的CRISPR-Cas9技术,被认为具有独特优势,未来极具潜力。详见财新此前报道《中国学者发明新型基因编辑技术引关注》

基因编辑技术是指能够让人类对目标基因进行“编辑”,实现对特定DNA片段的敲除、加入等。近年来,基因编辑成为生命科学研究领域的热门课题。

《自然》杂志执行主编尼克•坎贝尔曾评论韩春雨的成果,“虽然这项新技术还处于初期,但有一些理由让我们相信它与现在普遍使用的CRISPR-Cas9技术相比有多种优势,特别是在更精准的基因编辑方面。”

韩春雨1974年出生,本科毕业于河北师范大学,先后在中国农业科学院和中国协和医科大学攻读硕士和博士研究生,在从事了一段时间的研究工作之后,他选择回到河北石家庄,任教于河北科技大学。

韩春雨一鸣惊人,并引发热议,不仅基因编辑技术是近年来生物研究的热门领域,韩春雨的成果有望超越现存的先进技术,还因为这是一项完全由中国本土接受教育的科学家完成的重要成果。长期以来,欧美和日本等发达国家在生物研究方面占据绝对优势,中国本土的研究也多借助海归人才完成。而韩春雨团队并没有留学经历,其实验室设备环境也并非国内领先。

在获得国际学术大刊的认可之后,各家媒体踊跃报道这一在艰苦环境中做出的卓越成果,在一些报道中被称为“诺奖级”,韩春雨也迅速成名。

重复实验至今未成功

然而,韩春雨论文发表后的两个多月中,尚未有其他科研团队成功重复出韩春雨的实验结果。

上述博文作者巴尔焦在邮件中对财新记者表示,仅靠他的实验结论并不能证明韩春雨的工作是有问题的,因为他在不同的系统中进行了实验,并且选用了不同的基因,并不能算是一个严格的重复实验。

“如果用CRISPR技术,一般只要几个星期就能完成实验。韩春雨的文章也表示,使用NgAgo技术和CRISPR一样高效,这意味着如果NgAgo有效的话,很多实验室应该都已经成功重复出他的实验了。”巴尔焦说。

他的博客引发了包括蒙特柳在内的科学家更激烈的讨论,是不是他们的实验步骤全都出了问题,还是NgAgo本身有问题。

巴尔焦表示,当然仅靠他的实验结论并不能证明韩春雨的工作是有问题的,因为他在不同的系统中进行了实验,并且选用了不同的基因,并不能算是一个严格的重复实验。

但是近两个月来,所有做重复实验的人都失败了,巴尔焦称,仅美国就有几十个实验室这样反馈,“我觉得这已经可以表明韩春雨的研究是有问题的,我已经呼吁韩春雨能够把具体的原始数据和实验条件公开出来,来证明自己的文章是没有问题的。”

蒙特柳:韩应公布原始数据

多年从事基因修饰研究的蒙特柳在邮件中对财新记者详细介绍了韩春雨的论文发表至今,两个月以来他观察到的情况。

此前,蒙特柳一直采用从嗜热细菌中提取出的Argonaute蛋白TtAgo进行基因编辑,但是两年的实验都没有得到好的结果。在韩春雨的研究发表后,蒙特柳非常兴奋,他认为韩春雨选择了正确的细菌。他立马邮件恭喜了韩春雨,并希望能获得一些NgAgo质粒。韩春雨则回复说会很快将质粒提供给Addgene(一个全球科学家质粒共享的非盈利组织)。

6月初,韩春雨的NgAgo质粒如约出现在Addgene,世界各地的实验室开始紧锣密鼓的测试NgAgo的基因编辑性能。蒙特柳也得到了一些NgAgo质粒,并且进行初步的实验,但他很快意识到,实验的结果韩春雨的文章描述的不一样。

从6月末至7月初,蒙特柳一直在和国际上的实验室联络。他了解到,其他好几个实验室的NgAgo基因编辑实验,不论是针对人类、老鼠还是斑马鱼的细胞,无一例外都失败了。

蒙特柳告诉财新记者,他对巴尔焦非常了解,他认为巴尔焦的结论是可信的,并且已经在7月29日把巴尔焦的博客内容发给了韩春雨。

“我客气的问韩春雨可不可以分享他实验的原始数据和确切的反应条件,因为他这么好的结论不可能一次也重复不出来。”蒙特柳说,他理解因为商业上的原因,一些科学家有可能会在论文里隐瞒一些细节,来防止别人抢先从成果中获利。但是韩春雨已经把自己宝贵的反应物NgAgo质粒放到了公共的库里了,这说明他希望这个反应物能够像他文章里说的那样起作用。

蒙特柳强调,他与韩春雨并无个人恩怨,他曾多次在授课时介绍过NgAgo,并且在近期发表的一篇关于CRISPR的综述上也引用了韩春雨的文章。

“我们不要再浪费更多的人力、财力时间和实验动物,来进行做不出的实验。”蒙特柳呼吁在韩春雨提供更详细的实验说明之前,国际研究者们都停止使用NgAgo。

韩春雨:是非对错用科学去解决

7月30日,财新记者致电韩春雨询问实验重复性相关问题,他表示,科学上的事情不论是非对错要用科学去解决,不会对非科学的东西(指媒体)做出回应。并称巴尔焦在博客上的内容也是“非科学的”,“他说做得出来也好做不出来也好,从科学的角度上来说跟我们没什么关系”。

“对于科学工作的质疑要用学术手段来进行,”针对韩春雨研究引发的争议, 中国科学院神经科学研究所研究员仇子龙在一个在线问答社区如此回答,“鉴于文章刚刚发表两个月,我们还有很长时间,优化技术。至于质疑数据有没有故意造假,需要大学或是研究机构第三方的调查判断”。

通常,对于发表后出现问题的文章,学术期刊会启动调查程序,一旦确认问题存在,将会采用勘误、撤稿等处理形式。财新记者已经致信《自然》出版集团,询问期刊方是否会对该论文进行审查。截止记者发稿前,《自然》出版集团并未有对韩春雨研究结果的进一步发布,也并未回复财新记者的问询邮件。

来源:澎湃 财新网 医谷相关素材综合

(原标题:多国科学家:韩春雨基因编辑实验无法重复,要求公开所有数据)

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